Doc. MUDr. Filip Růžička, Ph.D. je přednostou Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Ústav stejně jako některá další laboratorní pracoviště v České republice vyhodnocuje vzorky stěrů pacientů, kteří by mohli mít onemocnění COVID-19.

Hodně se hovoří o tom, že vyšetření každého jednotlivého vzorku dlouho trvá…

Nezdá se to, ale jedná se o velmi precizní, pečlivou a náročnou práci. Stěry od pacientů se k nám dostanou ve formě speciálních tamponů, zanořených v odběrovém médiu. Vzorky musíme zkontrolovat – zda nedošlo cestou k nám k jejich znehodnocení. Důležitá je také průvodka, kterou je nutno zkontrolovat a případně telefonickou konzultací doplnit chybějící informace. Poměrně zdlouhavou „úvodní“ částí naší práce je vybalení vzorků z trojobalu, jejich roztřídění a izolace – dle typu vzorku a jejich počtu. Vše poté musíme zadat do informačního systému.

Tenhle popis zrovna nepřipomíná laboratorní vyšetření.

To teprve přijde na řadu. Vzorek je následně protřepáván, aby se z tamponu uvolnily případné virové částice, a teprve poté následuje samotná izolace. Používá se buď ruční izolace RNA (ribonukleové kyseliny), nebo může probíhat v automatickém izolátoru, který má však omezenou kapacitu a v současné době jsou také problémy s dostupností izolačních souprav na tyto přístroje.

Jak taková ruční izolace probíhá?

Obvykle je vzniklá suspenze pipetou přemístěna do nové zkumavky. Po přidání lyzačního roztoku je vzorek znovu protřepáván a inkubován tak, aby došlo k rozrušení virových částic a uvolnění nukleových kyselin. Vzniklý lyzát je přefiltrován přes speciální membránu, na níž se nukleové kyseliny navážou. Tuto membránu je třeba opakovaně proplachovat, centrifugovat, separovat a sušit. Cílem je odstranění látek, které by mohly znehodnotit reakci. Následuje aplikace roztoku, do kterého se uvolní přečištěná nukleová kyselina. V průběhu celého procesu je potřeba pracovat precizně, zejména je třeba důkladně a intenzivně vzorek protřepávat, dodržovat všechny předepsané inkubační časy a přesně pipetovat. Jakákoliv chyba se může projevit v kvalitě reakce – například vyvolat falešně negativní nebo naopak pozitivní výsledky. Samotný proces izolace zabere více než jednu hodinu, v případě většího počtu vzorků se doba výrazně prodlužuje. Použití automatického izolátoru může celý proces poněkud urychlit, trvá zhruba hodinu, a snižuje nároky na manuální práci.

Další čas zabere sanitace (dezinfekce, vyčištění) pracoviště po každé izolaci tak, aby nedošlo ke kontaminaci vzorků.

K dispozici jsou již také zjednodušené postupy izolace, ty ale mohou mít problém s nižší účinností a kvalitou. Kromě toho většinou zatím nejsou certifikované pro in vitro diagnostiku.

Co se pak provádí s již izolovanou nukleovou kyselinou?

Následuje přenesení roztoku, obsahujícího přečištěnou RNA, do zkumavky s reakční směsí samotné RT-PCR (reakce, která v konečném důsledku vede k mnohonásobnému zmnožení nukleové kyseliny a ta je následně detekována). Zkumavka je poté vložena do přístroje, tzv. thermocycleru, u něhož nastavujeme teploty, časy i počty cyklů. K jednotlivým vzorkům je potřeba zapsat konkrétní informace. Následně spustíme analýzu, která trvá více než hodinu.

Poté již znáte výsledek?

Následuje hodnocení výsledků dle charakteru křivek; ověření, jestli fungují všechny kontroly (pozitivní, negativní i interní kontrola) a posouzení, jestli je reakce validní. Výsledky musíme zapsat do laboratorního nemocničního informačního systému. Pozitivní vzorky jsou hlášeny vždy neprodleně na oddělení a na krajskou hygienickou stanici, i do databáze ISIN. Rychlost tohoto procesu ovlivňuje počet vyšetření, průměrně trvá jeden vzorek 4 – 5 hodin.

Proč mohou tuto činnost vykonávat jen speciálně proškolení laboranti?

Jde o úkony, které vyžadují preciznost a pečlivost. Zásadní je zde perfektní ovládnutí celého postupu tak, aby nedocházelo k chybám. To je možné jen za předpokladu kvalitního zaškolení – aby všechny kroky přešly laborantům „do krve“ a byly zautomatizovány. Zároveň je však třeba udržet pozornost tak, aby bylo vše pod kontrolou. Samozřejmostí je dodržování správné laboratorní praxe, včetně bezpečnosti práce a ochrany před infekcí.

To musí být náročné…

Náročné to určitě je, denně pracujeme s „živými“ organismy a musíme dbát na svou bezpečnost i na správnost celého procesu. Je třeba si uvědomit, že také laboratorní pracovníci jsou vystaveni velkému stresu, a ne všichni mají stejnou psychickou a fyzickou odolnost. I oni mají obrovskou zodpovědnost v rámci celého procesu boje s novým koronavirem SARS-CoV-2.